El impacto de recombinar moléculas de ADN in vitro en gusanos, moscas y ratones

Mario Enrique Zurita Ortega

---

El ADN recombinante que en este número de Biotecnología en Movimiento celebramos el 50 aniversario de su origen, ha tenido un gran impacto en modelos animales, que van desde la investigación de la biología molecular más básica y la biología del desarrollo en animales, hasta la fisiología, la inmunología, pasando por el cáncer y la neurobiología. Para tener una mejor comprensión de todas estas ramas de la biología animal, la pregunta fundamental más simple y directa es ¿cómo se regula el prendido y apagado de los genes (que los científicos llamamos técnicamente como su “expresión”) que modulan todos estos procesos en el tiempo y el espacio durante la vida de un organismo? Esta pregunta es importante en función de que, al final de cuentas, todas las señales químicas y físicas que percibe la célula en animales terminan prendiendo o apagando ciertos genes en el núcleo.

En el año de 1962, John Gurdon, en ese tiempo en la universidad de Oxford (Reino Unido) publicó un trabajo en el que demostró que trasplantar un núcleo de una célula de epitelio del intestino de Xenopus (sapo) a un huevo de otra especie de anuro (Rana), cuyo núcleo previamente fue inactivado o removido, genera un organismo adulto de Xenopus [1]. Este experimento, trascendental en biología del desarrollo, mostró que el genoma del núcleo trasplantado es totipotencial. Esto quiere decir que lleva toda la información para el desarrollo de un individuo y su genoma se puede reprogramar. Asimismo, demostró que todas las células de un organismo complejo llevan la misma información genética, es decir, todas tienen los mismos genes, pero solo algunos de ellos son los que determinan las características de cada tipo celular. Esto se conoce como la “ley de la equivalencia o de la conservación del genoma”.

Cómo se regulan los genes durante el desarrollo es una pregunta muy compleja. En este proceso hay muchas variables, por lo que primero tenemos que conocer a los genes. Antes del ADN recombinante (hace 50 años), no conocíamos a un nivel que nos permitiera entender cómo están regulados los genes en los animales y su estudio se centró en tres modelos clásicos que son: el nematodo (Caenorhabditis elegans); la mosca, (Drosophila melanogaster); y el ratón (Mus musculus).

La aplicación de las técnicas de ADN recombinante en el estudio de la regulación de la expresión de los genes (esto es, cuáles de ellos están prendido y cuáles apagados) en animales, al igual que en cualquier otro organismo, ha tenido diferentes etapas. La parte inicial consistió en conocer cómo están organizados en el genoma y caracterizar a los productos de la expresión de genes específicos, en particular los que codifican ARN mensajeros, que son aquellos a partir de los cuales se produce una proteína. Algunos de los primeros descubrimientos fueron inesperados, pero muy importantes. Por ejemplo, usando genomas virales capaces de infectar células animales, se descubrió que en los eucariontes (organismos cuyas células tienen núcleo) muchos genes están en fragmentos, es decir, tienen regiones que codifican para el producto del gen (exones) y segmentos que no codifican para el producto del gen (intrones), es decir, los genes están organizados por “piezas” que al expresarse se juntan y llevan la información para producir entre otras cosas una proteína [2, 3].

Asimismo, se descubrió que el genoma de los animales más complejos está lleno de elementos repetidos, muchos de ellos derivados de elementos de ADN que saltan en el genoma, llamados transposones [4]. También, se encontró que, en animales, la mayoría de los elementos regulatorios de un gen, están a distancias muy lejanas del gen que regulan. Esto significa que, en una hebra de ADN, los elementos que determinan el prendido o apagado un gen, no son contiguos a la parte del ADN que codifica para la síntesis del producto de ese gen, sino que están a muchos pares de bases (en la hebra de ADN) de distancia. Esto no ocurre en otros eucariontes, como las levaduras y no se diga en organismos como las bacterias [5]. Todos estos descubrimientos y muchos más han sido básicos para poder entender cómo están regulados los genes en animales.

Por otro lado, para poder hacer estudios de la regulación de un gen, necesitamos aislar al fragmento del genoma que contiene al gen de nuestro interés, así como sus posibles elementos de control. Una vez que se pudieron construir bibliotecas de ADN genómico y de ADN complementario (cADN) (Figura 1) se utilizaron diferentes estrategias para poder identificar genes particulares.

En el caso de genes de Drosophila, que tiene la ventaja de contar con una genética muy bien conocida y robusta, permitió usar, como sondas, a fragmentos de ADN derivados de regiones específicas del genoma, que se obtuvieron a través del “mapeo cromosómico” de mutantes, las cuales tienen deleciones (pérdida de fragmentos del genoma) en donde se ubica el gen de interés. Esto permite hacer “caminatas” de hibridación ( chromosome walking) en una librería genómica (Figura 2), permitiendo no solo aislar el gen, sino también regiones, que incluyen a las secuencias regulatorias. Un ejemplo de esto fue la clonación y caracterización de los genes que modulan la organización corporal de la mosca (esto es, cómo las diferentes partes del cuerpo de la mosca siguen un patrón muy preciso para formarse) y que también se encuentran en humanos [6].

En el caso de otros animales, como el ratón, que se usan como modelo en los laboratorios de investigación, así como en células humanas, se partió de clonar al cADN del gen de interés como primer paso para conocer cómo está regulado. Por ejemplo, identificar el cADN de los genes de globina (nombre genérico de las hemoglobinas y otras proteínas relacionadas con el transporte del oxígeno), no fue difícil, ya que los correspondientes ARN-mensajeros son muy abundantes en células eritroides, las cuales dan origen a los glóbulos rojos [7]. Un método muy utilizado en esos tiempos pioneros fue construir librerías de cADN en vectores de expresión en las que las clonas podían expresar, en Escherichia coli, la proteína codificada por el gen de interés (Figura 3). Posteriormente se usaba un anticuerpo específico para identificar las clonas positivas, cómo fue el caso de la clonación del receptor de glucorticoides, que es una de las proteínas que trasmiten la señal celular en respuesta a hormonas esteroides [8]. Con el cADN en mano, se pudo buscar la región genómica que contiene al gen de interés en una librería genómica y por lo tanto iniciar la caracterización de sus regiones regulatorias.

A partir de poder clonar genes específicos y sus posibles regiones de control, se diseñaron estrategias para entender cómo se regulan los genes en modelos animales. En Drosophila, se han obtenido mutantes, que, al mapearlas a lo largo de su genoma, se encontraron en regiones no-codificantes del gen, esto es, que no forman parte de las zonas de los genes que permiten la síntesis del producto del gen, lo que ha permitido identificar elementos regulatorios.

Sin embargo, el método más común para estudiar elementos de regulación consiste en hacer un organismo transgénico, con una construcción molecular en la que se pone la posible zona de control frente a un gen “reportero”, esto es, cuyo producto se puede visualizar fácilmente en el embrión u organismo completo, usando microscopía y haciendo inmuno-tinciones o midiendo la actividad (por ejemplo, de una enzima) del gen reportero. Aunque para este tipo de ensayos se pueden usar células en cultivo, el poder hacerlo en el organismo completo genera resultados más confiables.

En el ratón, el primer transgénico que pudo trasmitir un transgen a las siguientes generaciones fue realizado por varios grupos de manera simultánea en 1981 [9, 10, 11]. A la fecha, la principal estrategia para construir ratones transgénicos sigue siendo por medio de microinyecciones del ADN que se quiere introducir en embriones de ratón, en el estado de una sola célula.

Por otro lado, también se pueden transfectar (esto es, insertar el material genético) células totipotenciales (células embrionarias que tienen la capacidad de diferenciarse a cualquier tipo celular) con cualquier ADN de nuestro interés, para después identificar a las células en las que el transgen se insertó en su genoma. En algunos protocolos, se puede hacer que esta inserción suceda en un lugar predeterminado en el genoma. Una vez que se identifican estas células totipotenciales transgénicas, se inyectan a un embrión temprano, en el cual aún no han ocurrido las primeras etapas de diferenciación celular y así se obtienen ratones quiméricos (o transgénicos), de los cuales, algunos de sus descendientes provienen exclusivamente de las células con el inserto de ADN que se quiere estudiar. En la actualidad se puede introducir cualquier gen en cualquier lugar del genoma que deseemos con el fin de analizar una región regulatoria (esto es, de apagado o prendido de genes) en su contexto original en el cromosoma.

En el caso de la mosca, para hacer moscas transgénicas se utiliza un elemento transponible, conocido como “elemento P” de Drosophila, el cual fue modificado usando técnicas de ADN recombinante, de manera que se convierte en un vector de clonación (esto es, en un vehículo mediante el cual el ADN se pueda introducir) que lleva un gen que permite seleccionar a los organismos transgénicos [12]. ADN se introduce microinyectando embriones en su parte posterior, donde se localizan las células polares que van a dar origen a la línea germinal (las células que van a dar origen a los gametos, espermatozoides u óvulos), junto con el ADN que codifica para la enzima conocida como “transposasa”, que hace que el ADN del “elemento P” se inserte en el genoma de la mosca (Figura 4).

En el caso del gusano C. elegans, el ADN también es introducido por microinyecciones en huevos de hermafroditas o por balística, bombardeando micropartículas que llevan el ADN. Es importante hacer notar que, el poder hacer gusanos transgénicos fue muy importante para descubrimientos espectaculares como el ARN interferente (ARNi), con el cual se puede eliminar de manera específica el mensaje codificado en el gen que deseamos [13]. Por lo tanto, haciendo animales transgénicos, los ensayos de zonas regulatorias de un gen se puedan realizar en el organismo completo.

Gracias a los tres modelos animales que hemos discutido, estas técnicas se han consolidado y posteriormente se han aplicado a otros organismos, en algunos casos con enfoques biotecnológicos. Estos ejemplos del uso del ADN recombinante en modelos animales solo son una pequeña parte del impacto que ha tenido el estudio de la Biología de modelos animales. Su uso en técnicas de reprogramación de células diferenciadas de mamífero, a células pluripotenciales y a partir de estas diferenciarlas, a cualquier tipo celular, o incluso a un embrión temprano, sugieren un futuro espectacular para la Biología del Desarrollo en animales. Todo esto sigue evolucionando y el desarrollo de nuevas tecnologías, tales como el CRISPR/Cas (ver BiotecMov No. 5), que sin el ADN recombinante no se hubiera podido descubrir y no se podría aplicar. Por lo tanto, a partir del ADN recombinante, que inició hace 50 años, se ha podido abordar a un nivel molecular esa pregunta tan complicada, inspirada en los experimentos de John Gurdon, sobre ¿cómo se regulan los genes en animales durante el desarrollo, en el tiempo y en el espacio?

REFERENCIAS

1. Gurdon, J.B. (1962). The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. J. Embryol Exp. Morphol. 10, 622-640.
2. Chow, L.T., Roberts, J.M., Lewis, J.B., and Broker, T.R. (1977). A map of cytoplasmic RNA transcripts from lytic adenovirus type 2, determined by electron microscopy of RNA:DNA hybrids. Cell, 11, 819-836.
3. Berk, A.J. and Sharp, P.A. (1977). Sizing and mapping of early adenovirus mRNAs by gel electrophoresis of S1 endonuclease-digested hybrids. Cell, 12, 721-732.
4. Peronnet, F., J. L. Becker, J. Becker, L. d'Auriol, F. Galibert et al. (1978). A new retrotransposon with hormone modulated expression. Nucleic Acids Res. 14, 9017–9033.
5. Banerji, J., Olson, L. and Schaffner, W. (1983). A lymphocyte-specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunoglobulin heavy chain genes. Cell, 729–740.
6. Garber, R. L., Kuroiwa, A. and Gehring, W. J. (1983). Genomic and cDNA clones of the homeotic locus Antennapedia in Drosophila. EMBO J. 2, 2027-2036.
7. E F Fritsch, R M Lawn, T Maniatis (1980). Molecular cloning and characterization of the human beta-like globin gene cluster. Cell, 19, 959-972.
8. Weinberger C, Hollenberg SM, Ong ES, Harmon JM, Brower ST, Cidlowski J, Thompson EB, Rosenfeld MG, Evans RM. (1985). Identification of the human glucocorticoid receptor complementary DNA clones by epitope selection. Science. 228, 740-742.
9. Gordon, J. and Ruddle, F. (1981). Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214, 1244–1246.
10. Costantini, F. and Lacy, E. (1981). Introduction of a rabbit β-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294, 92–94.
11. Brinster, R., Chen, H. Y., Trumbauer, M., Senear, A. W., Warren, R. and Palmiter, R. D. (1981). Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27, 223–231.
12. Rubin, G. And Spradling, A. (1982). Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348–353.
13. Fire, A., Xu, S.Q., Montgomery, M.K., Kosta,s S.A., Driver, S.E. and Mello C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.

#q# CRISPR-Cas

[[M1]](# msoanchor1)https://biotecmov.ibt.unam.mx/services/pdfDownloader.php?id=NSoqXyoqNw==

Comparte este artículo en redes sociales