La manipulación del ADN de animales para entender la función de los genes

Luis Fernando Covarrubias Robles

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La ingeniería genética abrió hace 50 años la posibilidad de aislar genes en bacterias, y en relativamente poco tiempo derivó en tecnologías que permitieron la secuenciación de genomas completos, de los cuales el más ambicionado fue el genoma humano. Actualmente, la identificación de genes en el genoma, así como la actividad de sus productos (ARN o proteínas) ha incrementado significativamente gracias a los enormes avances en los procedimientos bioinformáticos. Sin embargo, desde que se secuenciaron los primeros genomas fue claro que la única forma de identificar los genes y, sobre todo, conocer su función dentro de un organismo, es a través de datos genéticos. Los estudios genéticos determinan la existencia y función del gen, valorando las consecuencias de su inactivación o alteración en el nivel de su actividad. La función en este sentido no se refiere exclusivamente a la actividad bioquímica o molecular del producto del gen, la cual a veces se puede predecir de su secuencia nucleotídica, sino también a su participación en procesos biológicos específicos en el contexto del organismo, desde las etapas más tempranas de su formación, hasta la edad adulta.

Descubriendo los secretos del genoma a través de la genética

La genética clásica se basa en asignar la función de un gen en base a una característica específica (i.e., fenotipo) cuando éste ha sido mutado (i.e., alterado su secuencia nucleotídica). Es decir, la función que se deduce del fenotipo es conocida pero el gen responsable no. En este panorama, usando técnicas de clonación de ADN, los investigadores buscan al gen en el ADN rastreando la mutación que da lugar al fenotipo específico. Muchos genes se han identificado y aislado por esta ruta, y aun actualmente sigue siendo una alternativa viable.

#q# Vector de clonación

La genética reversa, en contraste con la genética clásica, asigna la función de un gen buscando el fenotipo resultado de una mutación específica dirigida a ese gen. Es decir, el gen es conocido pero la función, en el contexto del organismo, no. La secuenciación del genoma condujo a un drástico cambio en las estrategias para descubrir la función de los genes, pues teóricamente ahora se cuenta con la secuencia de todos los genes, y en algunos casos inclusive la actividad bioquímica o molecular predicha por análisis bioinformático, pero la función en el contexto del organismo permanece oculta. En este panorama las limitantes han sido los métodos, eficientes y específicos, que permiten la modificación del genoma del organismo, tal que ante una mutación diseñada por el investigador, se determine el fenotipo resultante.

Las modificaciones genómicas en el contexto de organismos sencillos se han limitado a seleccionar aquellos que llevan mutaciones, ya sea generadas de manera no dirigida (e.g. con mutágenos) al estilo de la genética clásica, o diseñadas para un gen específicos como lo propone la genética reversa, para luego identificar el gen alterado o el fenotipo generado, respectivamente. Es decir, cuando la complejidad del organismo es simple (e.g., pocos tipos celulares) y el tamaño de su población es muy grande, la relevancia de la genética reversa no se aprecia a plenitud. En organismos multicelulares, compuestos de tipos celulares diversos, cada uno con el mismo genoma pero con diferentes genes prendidos y apagados (definiendo lo que los científicos llamamos “el patrón de expresión de genes” específico de un tipo celular), y donde regularmente el tamaño de la progenie es reducida, el impacto de la genética reversa se hace patente y permite valorar los grandes esfuerzos dirigidos en los años recientes a desarrollar métodos cada vez más precisos para modificar el genoma.

El arte de modificar el genoma de animales a modo: la Ingeniería Genómica.

Desde los albores de la genómica, no hay duda de que el mejor medio para estudiar la función de los genes de los animales, rama filogenética a la que pertenecen los humanos, es estudiando los genes en el contexto del desarrollo embrionario. También desde ese entonces, era fácil apreciar que, dada la homología y similitud entre los genes de diversos animales, la función de los genes humanos se puede estimar estudiando sus homólogos en animales. A partir de este razonamiento, se propuso enfocar los esfuerzos para determinar la función génica en modelos animales que hubieran mostrado la factibilidad de realizar análisis genéticos en el contexto del desarrollo embrionario. Los modelos animales seleccionados en ese entonces fueron: el gusano (Caenorhabditis elegans), la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) y el ratón (Mus musculus), y al poco tiempo también se incorporó a la lista el pez cebra (Danio rerio) (Figura 1). Resultaba importante entonces que la comunidad científica se abocara a determinar la secuencia completa de sus genomas. Actualmente, conforme se ha facilitado la determinación de la secuencia de genomas, el número de especies animales donde se puede determinar la función génica ha aumentado.

Si bien la estimación de la función de genes humanos puede estimarse de sus homólogos en cualquier animal donde se determine, sin lugar a duda la función génica en mamíferos representa el mejor referente. Destaca en este sentido el ratón, especie que, dada su limitada progenie y la relativamente larga duración del ciclo de vida, ha motivado al desarrollo de manipulaciones genómicas cada vez más específicas que faciliten la utilización de la genética reversa. Así inició la Ingeniería Genómica. Los primeros intentos para modificar el genoma del ratón ocurrieron previo a la era genómica, logrando generar ratones transgénicos a través de microinyectar genes recombinantes directamente al huevo fertilizado (1980-1981). Si bien esta metodología se volvió rutinaria en la década de 1980, su contribución a la determinación de la función génica fue limitada, ya que en esencia solo se pudo explorar las consecuencias de añadir un gen al genoma, y en pocos casos, se pudo determinar las consecuencias fenotípicas, cuando la actividad de un gen se elimina. Un ejemplo clásico son los ratones gigantes que producen mayor cantidad de hormona de crecimiento, desde un transgén que es activo exclusivamente en el hígado.

Dos hallazgos significativos condujeron a un cambio radical en las estrategias para determinar la función génica en ratones. Por un lado, el establecimiento de líneas celulares derivadas de la masa celular interna del embrión pre-implantación (1981) y la demostración de que retienen la propiedad pluripotente (1984), es decir, la capacidad para contribuir a todos los tipos celulares del embrión, incluyendo los componentes de la línea germinal (esto es, a los “gametos”); a estas células se les denominó “células troncales embriónicas” (ESC por sus siglas en inglés) (Figura 2). Por otro lado, se estableció un protocolo para promover y aislar eventos de recombinación específica (1987), de tal manera que se volvió posible modificar cualquier gen en cultivo celular, incluyendo cultivos de ESC (1989). La fusión de estos dos hallazgos condujo a la generación de multitud de ratones derivados de las ESC modificadas genéticamente en cultivo, los cuales mostraron el fenotipo asociado al gen manipulado. Genes esenciales para la formación de órganos como el hígado o el páncreas o para estructuras como las extremidades o la cabeza, se identificaron usando estos procedimientos.

En base a las metodologías anteriores, las estrategias para modificar genes de ratón específicamente se han ido afinando. A través del uso de herramientas de origen bacteriano, como factores de transcripción (proteínas que controlan la actividad de los genes) o recombinasas (proteínas que promueven que dos piezas de ADN se recombinen para producir nuevas combinaciones), se han desarrollado estrategias para contender con la propiedad de muchos genes en animales, de no solo realizar una función, sino tener funciones múltiples en distintos procesos que ocurren en el embrión o durante la vida adulta.

De esta manera, actualmente es posible promover la síntesis de los productos codificados en un gen de manera restringida en el tiempo (i.e., etapas del desarrollo embrionario o vida adulta) y en el espacio (i.e., limitada a ciertos tejidos), o generar ratones donde la modificación genética ocurre exclusivamente en tipos celulares particulares, de tal manera que el fenotipo observado (consecuencia del gen mutado) se asocie directamente a un linaje celular u órgano específico (Figura 3).

La técnica de CRISPR/Cas9 (ver BiotecMov No. 5, 2016), también de origen bacteriano, es la herramienta que más recientemente se incorporó a la ingeniería genómica del ratón y otros animales. Diversas variantes de CRISPR/Cas9 han facilitado la incorporación de modificaciones genéticas, tanto en células ESC como directamente en el ratón, a tal grado que actualmente la posibilidad de replicar con exactitud en ratones, alteraciones genéticas presentes en humanos, ya no es un reto difícil de alcanzar.

Detrás de todas las enfermedades, alteraciones en la función génica

Muchas enfermedades humanas derivan de alteraciones en la función génica. Por tanto, los avances recientes que han incrementado la especificidad y eficiencia para modificar el genoma, no solo del ratón sino también de células humanas, así como el desarrollo de modelos de laboratorio que reproducen procesos embrionarios y derivan tipos celulares específicos, repercutirán directamente en entender la función génica en asociación a enfermedades humanas. Por ejemplo, la capacidad actual para generar organoides (i.e., estructuras que asemejan órganos tales como intestino, hígado, cerebro) a partir de células troncales representa un importante avance para caracterizar la función de los genes del genoma humano (Figura 4).

Es notable la derivación de organoides a partir de células ESC, ya que desde hace varios años se han establecido ESC humanas y éstas han mostrado no solo la capacidad para diferenciarse a distintos tipos celulares sino, además, tener el potencial para derivar organoides tan complejos como los que se asemejan al cerebro. La reprogramación celular, proceso experimental que permite obtener células troncales pluripotentes a partir de células diferenciadas adultas (denominadas células troncales pluripotentes inducidas; iPSC por sus siglas en inglés) es particularmente relevante en este contexto. Actualmente se han logrado derivar iPSC de pacientes que sufren alguna enfermedad, diferenciarlas o generar organoides, y a partir de ahí estudiar las alteraciones en la función génica asociadas. Modelar en cultivo enfermedades tan complejas como las neurodegenerativas o causante de la demencia, es sin lugar a duda, un nicho para estudiar finamente la función de los genes.

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