¿Qué hace el sistema CRISPR-Cas en Salmonella Typhi, el agente causal de la fiebre tifoidea?

Liliana Medina Aparicio, Eira Donaji Aguirre Partida, Edmundo Calva e Ismael Hernández Lucas

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Las bacterias son formas celulares microscópicas, relativamente menos estructuradas comparadas con las de organismos multicelulares. Estos microorganismos se originaron al menos hace 3,500 millones de años y se han diversificado en todos los ambientes de la Tierra, considerándose ‘cosmopolitas’. Las bacterias se han enfrentado, adaptado y diversificado a climas extremos, la carencia de nutrientes y a la presencia de depredadores. Sus peores enemigos son los bacteriófagos, o fagos —virus que infectan bacterias— los cuales utilizan específicamente la maquinaría molecular de las bacterias para multiplicarse y diseminarse en el ambiente. Tales entidades (proto)biológicas son capaces de erradicar desde el 4 al 50% de la población bacteriana que se genera diariamente en el mar.

Para escapar de los fagos

Diversas estrategias han sido seleccionadas evolutivamente en los grupos bacterianos, para contender con el continuo ataque viral. Como los virus deben reconocer la presencia de ciertos receptores en la membrana celular para iniciar el proceso de infección, han surgido, por ejemplo, cepas bacterianas que son capaces de modificar dichos receptores y evitar ser infectadas [Fig. 1-A]. Más aún, en el caso de que un fago logre unirse a la membrana bacteriana e inyectar su material genético, otros grupos de bacterias han desarrollado mecanismos de defensa a través de un sistema de modificación y restricción de los ácidos nucleicos [Fig. 1-B]. Estos mecanismos funcionan con base en una clase de ‘tijeras moleculares’ llamadas endonucleasas de restricción, las cuales son capaces de reconocer y realizar cortes en secuencias específicas en el ADN. Así mismo, las bacterias también pueden activar ‘programas genéticos’ para provocar una infección abortiva, que impida la replicación del virus, desencadenando una muerte celular; es decir, algunas bacterias se ‘suicidan’, evitando que los fagos se repliquen en ellas y pueda infectar otras células de su entorno [Fig. 1-C]. [3].

Hace algunos años, en una serie de descubrimientos importantes para la microbiología en décadas, se elucidó un ‘sistema inmune adaptativo’ presente en los genomas bacterianos denominado por el acrónimo CRISPR-Cas. Este sistema proporciona una estrategia novedosa de detección y eliminación de agentes genéticos exógenos como los fagos, cuyas instrucciones se ubican en regiones localizadas en los genomas bacterianos [Figura 1]. El acrónimo CRISPR (por Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, podría traducirse como: repeticiones [de secuencias de ADN] cortas, palindrómicas —que se leen en ambos sentidos a partir de un punto de simetría, como en “Anita lava la tina”—, agrupadas y regularmente espaciadas [Fig. 1-D]; investigaciones concurrentes permitieron encontrar conjuntamente un grupo genes para ‘proteínas asociadas al CRISPR’, (abreviado ‘Cas’) que, en los organismos donde el sistema CRISPR-Cas fue originalmente descrito (extremófilos, lactobacilos y patógenos humanos), proporciona resistencia bacteriana dirigida contra virus o secuencias exógenas de ADN, el cual se ha ido heredando y adaptando a diversas condiciones [1, 2].

Un mecanismo sofisticado de guerra molecular

El sistema CRISPR-Cas funciona, por un lado, mediante las proteínas Cas, las cuales funcionan como endonucleasas de restricción especializadas; sorprendentemente las secuencias de ADN de CRISPR tienen un origen viral, y van alternadas entre unos fragmentos espaciadores. Se supone que, a través de la evolución, algunas proteínas Cas han ‘identificado’ ADN invasores —con secuencias distintas a las propias— y los han integrado en un ‘catálogo’ de fragmentos en el bloque de CRISPR. Cuando aparecen ADN de fagos invasores, esta región se activa, sintetizando unas ‘guías’ y acopladores de ARN quienes, incorporados a las proteínas Cas, reconocen a estas secuencias y realizan cortes específicos que inutilizan el ADN viral, evitando la infección. Es por demás relevante mencionar que los procesos que realizan los componentes de sistema CRISPR-Cas, asociados con mecanismos de reparación y recombinación, son ahora utilizados en la ‘edición de genes’ en varias especies de bacterias, hongos, insectos, plantas y células humanas; es decir, actualmente el sistema CRIPSR-Cas es un recurso experimental y aplicado en áreas de la biotecnología industrial, médica, agrícola, etc. [Fig. 2]; también, fue el motivo para conceder el Premio Nobel de Medicina y Fisiología de 2020 a dos investigadoras.

CRISPR-Cas realiza funciones biológicas alternativas en otras bacterias

Se ha encontrado que los sistemas CRISPR-Cas se encuentran distribuidos en una amplia variedad de grupos bacterianos y se han identificado funciones biológicas alternativas en algunos de ellos. Por ejemplo, en la bacteria Myxococcus xanthus, habitante de suelos, CRISPR-Cas participa en la formación de esporas; en patógenos de humanos tales como Streptococcus mutans, las cepas deficientes en proteínas Cas son más sensibles al estrés oxidativo y a los cambios de temperatura y, en el patógeno de vegetales, roedores y humanos Pseudomonas aeruginosa, CRISPR-Cas está implicado en la movilidad y en la formación de superficies protectoras a la desecación y antibióticos (biopelículas). En bacterias tales como Campylobacter jejuni (asociada a enfermedades intestinales) y Neisseria meningitidis (causante de neumonías), se han visto involucrados en la invasión y replicación de células epiteliales de intestino y pulmón, respectivamente [Fig. 3].

¿Cómo funciona CRISPR-Cas en el patógeno de humanos Salmonella Typhi?

Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) es una bacteria gastrointestinal que infecta exclusivamente a los humanos, provocando fiebre tifoidea. Este padecimiento es un problema de salud pública, ya que 2 millones de personas alrededor del mundo son infectadas anualmente por estas bacterias, de las cuales 200 mil pierden la vida, siendo los países en desarrollo los de mayor incidencia de esta enfermedad. Desde hace varios años, en nuestro grupo de investigación en el Instituto de Biotecnología de la UNAM, hemos hecho preguntas enfocándonos en varios aspectos de la biología de S. Typhi y recientemente, hemos abordado la caracterización del sistema CRISPR-Cas presente en este patógeno de humanos.

Nuestros estudios sugerían que CRISPR-Cas en este grupo bacteriano tenía una función inmunológica limitada contra fagos o ADN exógeno; sin embargo, la gran conservación genética en el género Salmonella sugiere que podría estar participando en otros procesos biológicos; iniciamos entonces la búsqueda de la función de CRISPR-Cas en S. Typhi. Mediante técnicas de biología molecular, fuimos eliminando cada uno de los genes cas —que codifican a las proteínas Cas— así como las secuencias CRISPR. Las cepas resultantes fueron sometidas a condiciones de crecimiento similares a las que se presentan en el organismo humano, con el objetivo de conocer su función en su hospedero natural: ¿son igual de infectivas? ¿más o menos virulentas? Los experimentos de nuestro laboratorio demostraron que las mutantes del sistema CRISPR-Cas son, por ejemplo, incapaces de crecer en presencia de sales biliares presentes en los intestinos de humanos), además de que producen una mayor cantidad de una matriz extracelular en forma de biopelícula, lo cual les resta movilidad en el medio digestivo; no obstante, estas mutantes poseen mayor capacidad para infectar y replicarse en células sanguíneas denominadas macrófagos. Los datos obtenidos en nuestro grupo apuntan a que este comportamiento está relacionado con la composición de la envoltura celular, ya que las S. Typhi modificadas, que son deficientes en el sistema CRISPR-Cas, carecen de algunas proteínas (llamadas porinas), que están involucradas en el tránsito de moléculas a través de la membrana externa [Fig. 3] [4, 5, 6].

Hemos seguido investigando las causas de estos cambios funcionales y hemos demostrado que CRISPR-Cas aquí, es un regulador genético de una proteína que induce la síntesis de porinas, denominada OmpR. Desde entonces, se han generado múltiples preguntas e hipótesis relacionadas con el proyecto; por ejemplo: ¿En qué otras condiciones de vida libre y de patogénesis de S. Typhi es relevante CRISPR-Cas?, ¿Cómo son las redes de regulación (a nivel del genoma) que este sistema controla? ¿Existe una conservación de funciones de este sistema genético en otros patógenos de humanos, o es exclusivo de S. Typhi? y finalmente, ¿cómo podríamos combatir la fiebre tifoidea y otras enfermedades mediante CRISPR-Cas? Nuestra contribución actual en la regulación genética de CRISPR-Cas y su papel en la fisiología del agente causal de la fiebre tifoidea, brinda la oportunidad de profundizar y abordar otros sistemas CRISPR-Cas en microorganismos patógenos de animales, plantas, y humanos, así como en microorganismos no patógenos. Para responder las incógnitas y encontrar terapias efectivas, se requieren sin duda más investigaciones para tener una imagen más amplia, precisa y definida sobre el papel biológico de este sistema en bacterias.

Referencias

El desarrollo y más detalles de este proyecto se describen en las referencias 4, 5 y 6.

1. Hille F, H Richter, SP Wong, M Bratovic, S Ressel & E Charpentier (2018). The Biology of CRISPR-Cas: Backward and Forward. Cell, 172: 1239-59. DOI: 10.1016/j.cell.2017.11.032

2. Issacson W (2021). The Code Breaker. Jennifer Doudna, Gene Editing and the Future of the Human Race. NY: Simon & Shuster.

3. Labrie SJ, JE Samson, S Moineau (2010). Bacteriophage resistance mechanisms. Nat Rev Microbiol 8: 317-327. DOI: 10.1038/nrmicro2315.

4. Medina-Aparicio L, JE Rebollar-Flores, AA Beltrán-Luviano, A Vázquez, RM Gutiérrez-Ríos, L Olvera, E Calva & I Hernández-Lucas (2017). CRISPR-Cas system presents multiple transcriptional units including antisense RNAs that are expressed in minimal medium and upregulated by pH in Salmonella enterica serovar Typhi. Microbiology 163 (2): 253-265. DOI: 10.1099/mic.0.000414.

5. Medina-Aparicio L, S Dávila, JE Rebollar-Flores, Edmundo Calva & I Hernández-Lucas (2018). The CRISPR-Cas system in Enterobacteriaceae. Pathog Dis 76(1). DOI: 10.1093/femspd/fty002.

6. Medina-Aparicio L, S Rodriguez-Gutierrez, JE Rebollar-Flores, ÁG Martínez-Batallar, BD Mendoza-Mejía, ED Aguirre-Partida, A Vázquez, S Encarnación, E Calva & I Hernández-Lucas (2021). The CRISPR-Cas system is involved in OmpR genetic regulation for outer membrane protein synthesis in Salmonella Typhi. Front Microbiol 12: 657404. DOI: 10.3389/fmicb.2021.657404.

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