¿Cómo eliminan los bioinsecticidas de las bacterias Bt a los mosquitos?

Samira López-Molina y Alejandra Bravo

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Control biológico de mosquitos vectores de enfermedades en humanos

Por medio de sus picaduras, los mosquitos o zancudos de las especies Aedes aegypti y Anopheles spp. transmiten enfermedades en humanos como el dengue, Zika, chikunguña, fiebre amarilla y malaria; su incidencia es muy alta en zonas tropicales (con temperaturas entre 24-39°C) y se le puede considerar uno de los organismos que causa más muertes a nivel mundial. Sin embargo, aún no existen vacunas para prevenir estas enfermedades (excepto contra fiebre amarilla). Por lo tanto, es importante usar repelentes en zonas infestadas, además de combatir al mosquito en alguna etapa de su ciclo de vida y desarrollar tratamientos más efectivos.

Considerando el control de las poblaciones de mosquitos, sabemos que se reproducen fácilmente en cantidades pequeñas de agua presente en macetas, botellas, latas viejas, etc., que inconscientemente abandonamos. Allí depositan sus huevecillos que en 7-10 días generan una gran cantidad de mosquitos adultos nuevos, los cuales viven más de 30 días. Los huevecillos desecados son viables por varios años y pueden eclosionar cuando son hidratados. Actualmente la estrategia de combate es con base en insecticidas químicos como los aplicados con botes de espray o bombas, lo cuales suponen otro riesgo para nuestra salud, ya que son tóxicos para los humanos y requieren mucho tiempo para degradarse.

En el camino hacia un control efectivo que no cause daño a los humanos, han surgido estrategias compatibles con el medio ambiente, usando productos biodegradables como las toxinas insecticidas de las bacterias Bacillus thuringiensis (Bt) que no son tóxicas para animales, ni para humanos. El control biológico, es una forma de manejo de poblaciones de organismos nocivos, a partir de la actividad de otras especies, que normalmente forma parte de su cadena trófica. Las Bt representan la estrategia de control biológico de mosquitos más usado comercialmente. Estas bacterias son ubicuas, se ha aislado de todas partes del mundo y de muy diversos ecosistemas. Varios miembros de esta especie producen toxinas que son altamente específicas para diferentes tipos de insectos ‘blanco’ (ver BiotecMov. 24: 25 y 29.2).

Toxinas bioinsecticidas específicas producidas por bacterias

Se conoce bien que las bacterias Bt presentan dos fases de crecimiento en su ciclo de vida: uno vegetativo, donde las bacterias se duplican por bipartición. Pero cuando se presentan limitaciones en nutrientes, se inicia un programa de diferenciación de bacterias vegetativas a esporas. Las esporas permanecen latentes por mucho tiempo hasta que encuentran un medio adecuado para ‘germinar’ y multiplicarse de nuevo como bacterias. Durante la esporulación de Bt se sintetizan algunos componentes moleculares que le ayudan a colonizar nichos muy particulares, como pueden ser el cuerpo de las larvas de insectos. ¿Cuáles son estos componentes y cómo funcionan? Cuando se forma la espora también se producen grandes cantidades proteínas insecticidas formando cristales paraesporales (proteínas bien ‘empacadas’ en la célula madre, junta a la espora), que por eso se conocen como proteínas Cry. Existe una amplia diversidad de proteínas Cry con diferente especificidad; algunos miembros de esta familia son tóxicas contra insectos lepidópteros (mariposas), coleópteros (escarabajos), dípteros (mosquitos), himenópteros (hormigas), ácaros y también contra otros invertebrados como nematodos, gusanos planos y protozoarios [3]. Las Bt también puede sintetizar otras toxinas insecticidas que son diferentes y también forman cristales paraesporales; este otro grupo se denominan proteínas Cyt y solamente son tóxicas a mosquitos y son muy interesantes porque son capaces de potenciar la actividad insecticida de las toxinas Cry contra mosquitos.

Una misma cepa de B. thuringiensis subespecie israelensis (Bti) produce tres toxinas Cry (clasificadas como Cry4A, Cry4B y Cry11A) y dos toxinas Cyt (Cyt1A y Cyt2A); todas ellas tienen actividad insecticida elevada contra larvas de diferentes mosquitos. Se ha demostrado que la toxina Cyt1A puede aumentar la letalidad de Cry11A y de Cry4B hasta 18 veces. La pregunta entonces es ¿Cómo funciona esta pareja de toxinas? ¿Por qué son sinérgicas?

Desbaratando intestinos a dos fuegos

A partir de esto, nos propusimos indagar cómo ocurre esta sinergia: pero vamos por partes. Actualmente sabemos que las toxinas Cry, en forma de cristal paraesporal derivadas de Bt son comidas por las larvas; luego son solubilizadas en el ambiente alcalino (alto pH) presente en el intestino larvario (protoxina soluble), para ser activadas por proteasas presentes allí. Entonces, la toxina activada interactúa con proteínas-receptoras que están en la superficie de las células del intestino hacia el lumen intestinal: hay receptores muy abundantes con actividad enzimática como la amino·peptidasa y la fosfatasa alcalina; otros receptores menos abundantes son la caderina y el transportador ABCC2. Cuando la toxina Cry se une a estos receptores se induce su asociación estructural formando un oligómero; es decir, varias toxinas unidas que finalmente forman un micro-poro en la membrana de la célula —realmente agujeros de unos cuantos nanómetros (10⁻⁹ m) de diámetro—; esto provoca la destrucción de las microvellosidades del intestino larvario para finalmente matar al insecto. En el caso de las toxinas Cyt se ha visto que aparentemente no se unen a proteínas-receptoras, sino que interactúan directamente con los lípidos presentes en la membrana de los intestinos de mosquitos; también se insertan formando otros poros que trastornan el funcionamiento del intestino. Respecto al sinergismo de estas dos toxinas, se ha propuesto que Cyt funcionaría como un receptor para las toxinas Cry y, bajo este modelo, Cyt se une a la membrana para después interaccionar con gran afinidad con las toxinas Cry, provocando su oligomerización, su inserción en membranas, la descompensación y finalmente, la muerte de la larva.

Una sinergia misteriosa pero efectiva

Para resolver estas hipótesis y saber cómo interactúan estas proteínas y cómo es que se incrementa su letalidad sobre dípteros, decidimos analizar el efecto de las toxinas Cry11Aa y Cyt1Aa in vivo. Esto requiere comparar lo que sucede en sistemas experimentales donde las larvas son crecidas en el laboratorio, para utilizarlas aplicándoles diferentes tratamientos en este estado de desarrollo (antes de ser adultos voladores). ¿Cuántos tratamientos y variables son necesarios? Planeamos medir y comparar bajo el siguiente esquema: con las proteínas Cry11A y Cyt1A administradas de manera individual y mezcladas (para inducir su sinergia), y utilizando sus tres formas; es decir, como cristales (obtenida directamente de las bacterias), protoxina soluble (disuelta en una solución de alto pH), y la toxina activada (después de un tratamiento con proteasa). Realizamos dos tipos de registro: (1) haciendo bioensayos de mortalidad, que significa determinar cuántas larvas quedan vivas o cuantas mueren después de alimentarlas por 24 h con las proteínas y, (2) localizando su posición final dentro del tejido intestinal, por medio de microscopía de fluorescencia confocal.

Para ciertas comparaciones, también usamos toxinas mutantes no tóxicas (Cry11Aa-E97A y Cyt1Aa-V122E, con cambios en un solo aminoácido c/u, obtenidas por ingeniería genética), las cuales están afectadas en su capacidad de acoplarse y formar poros por lo que no son tóxicas. De entrada, observamos que tanto la toxina activada como la protoxina de Cry11Aa soluble no matan a las larvas. Solo las Cry11Aa en forma de cristales paraesporales tienen actividad insecticida; las larvas evaden ingerir protoxina soluble y la toxina activada, por eso estas moléculas no matan a las larvas. Además, corroboramos los datos de mortalidad de larvas producida por una mezcla 1:1 de cristales Cry11Aa + Cyt1Aa, la cual mostró un notable sinergismo.

Marcamos previamente las proteínas Cry11Aa y Cyt1Aa (cristales, toxina soluble y protoxina) con colorantes fluorescentes (dos colorantes 'Alexa succinil ester' que emiten color verde o color rojo), los cuales se une a un tipo de aminoácidos (lisinas, Lys), presentes en estas proteínas; después las administramos a las larvas por un cierto tiempo junto a su alimento y después de 3-24 h se diseca el intestino de las larvas y se preparan las muestras para microscopía óptica.

Durante este estudio, observamos con mucho detalle los cambios estructurales del intestino medio de las larvas dependiendo de cada tratamiento. Cuando alimentamos con Cry11Aa , observamos un cambio notable en la morfología de unas estructuras llamadas 'caeca gástrica', que semejan a vesículas unidas a la parte inicial de este órgano, que son importantes en la absorción y recirculación de nutrientes y que normalmente alojan bacterias en su interior [Fig. 1]. Asimismo, fotografiamos células del epitelio intestinal (en la pared por dentro del intestino), que es donde se puede ver si las toxinas, se unen a la membrana de células con microvellosidades que ve hacia el lumen, o ver si ocurren otros fenómenos como la entrada al interior de las células y si eventualmente, provocan su destrucción [Fig. 1].

En términos generales, en larvas alimentadas con cristales de Cry11Aa por un día, se observan deformaciones y cambios de varias zonas del intestino (caeca y parte posterior); en el caso de la mezcla de las proteínas en forma de cristal paraesporal de Cry11Aa y Cyt1Aa, el daño se observa desde las 3h. Los cristales de Cyt1Aa solos inducen la muerte de las larvas a las 24h, pero no afectan la morfología de la caeca gástrica, lo que sugiere que los dos tipos de toxinas afectan de manera diferente al sistema digestivo de la larva.

Al alimentar larvas con cristales de Cry11A marcados con el colorante fluorescente verde, observamos que se llena el lumen intestinal; la Cry11Aa se une luego a la microvellosidad y también se introduce dentro de algunas células desde las 3h de intoxicación. A las 9h se observan daños y destrucción celular. En un experimento crucial, realizamos tratamientos con mezclas de cristales donde la proteína Cry11Aa se marcó de color verde y la proteína Cyt1Aa de color rojo para analizar cuál sería la dinámica de su efecto sinérgico. En el microscopio es posible observar a los dos tipos de cristales en el lumen intestinal, también el daño celular y la co-localización de ambas toxinas marcadas en la parte exterior de las células intestinales. En estos experimentos confirmamos que Cry11Aa se introduce dentro en las células (Fig. 2).

Las observaciones y el análisis de las microfotografías de ambas toxinas, nos sugieren que: (a), las toxinas como cristales matan a las larvas, para poder hacer esto deben de solubilizarse y activarse in situ dentro del intestino larvario; (b) aunque individualmente afectan el intestino por distintos mecanismos, en conjunto son más letales y, (c) el análisis fino a nivel nanoscópico reveló que la toxina Cyt1Aa contribuye al anclaje de Cry11A en membranas, lo que resula en un aumento de su función tóxica al incrementar su unión a membranas y la formación de poros en las células.

Este es el primer trabajo que muestra una secuencia de cambios morfológicos en el tejido intestinal, así como la localización de las toxinas in vivo cuando las larvas ingieren estos bioinsecticidas. Esto permite entender cómo funcionan estas toxinas y poder así manipularlas para mejorar la toxicidad de los cristales Cry y Cyt en larvas de mosquitos. La finalidad hacia adelante es desarrollar productos sustentables para un control mucho más efectivo de estos insectos que son vectores de padecimientos en humanos que tienen un impacto demográfico enorme.

Referencias

La siguiente publicación incluye los resultados reseñados en el presente artículo.

1. López-Molina S, NA do Nascimento, MHNL Silva-Filha, A Guerrero, J Sánchez, S Pacheco S, SS Gill, M Soberón & A Bravo (2021). In vivo nanoscale analysis of the dynamic synergistic interaction of Bacillus thuringiensis Cry11Aa and Cyt1Aa toxins in Aedes aegypti. PLoS Pathog 17(1): e1009199. DOI: 10.1371/journal.ppat.1009199

2. Samira López. Resumen del proyecto (clip de video) https://bit.ly/cry-cytIBT1

3. Bravo A, SS Gill & M Soberón (2007). Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon 49: 423-435. DOI: 10.1016/j.toxicon.2006.11.022

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